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从微量样本中同时提取mRNA和天然蛋白

日期:2014-05-15 00:00:00

在生物学研究的许多领域,样本量往往很有限,特别是人体细胞和组织,如卵泡和胚胎干细胞。但是,研究人员经常需要开展多项分析,比如基因表达和蛋白分析。这就需要从同一个样本中分离出RNA和蛋白质。不过,样本本来就很少,分成两份来操作更是不可能。

目前已有一些操作方案,能从少量样本中同时提取出DNA、RNA和蛋白质。然而,大部分方法都需要将蛋白质变性,以保护RNA不受降解,这就使得一些需要天然蛋白的分析无法开展,比如酶活分析、非变性PAGE或免疫共沉淀。

为此,哥本哈根大学的Tonny Studsgaard Petersen和Claus Yding Andersen开发出一种新方法,能从含有少量细胞的样本中同时纯化mRNA和天然蛋白。这种方法改良自现有的变性磁珠oligo-dT方案,在天然状态下分离mRNA和蛋白质,同时在4°C且还原剂存在时开展RNA分离,以减少RNA的降解。

他们采用Dynabeads® Oligo (dT)25磁珠来选择性分离mRNA,同时以非离子型去污剂来取代离子型去污剂,以便更好地保护蛋白质的天然状态。因此,裂解液中仍含有活性的RNase,但通过将mRNA与磁珠杂交时的温度降至4°C,可有效抑制RNase的活性,同时他们延长了杂交时间。

研究人员在新生大鼠卵巢、人卵巢颗粒细胞(hGC)和人黄体(CL)上检验了这种新方法。他们测定了抑制素α亚基(Inha)和两个看家基因(Rpl32和Gapdh)的mRNA表达,并测定了磷酸二脂酶(PDE)、caspase-3和乳酸脱氢酶(LDH)的酶活以及GAPDH和β-actin的免疫沉淀。

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结果表明,这种方法在分离RNA的数量和质量上与现有的试剂盒相当,同时保留了有功能的蛋白质。他们也检验了标准oligo-dT方案下的RNA产量,发现Inha 、Rpl32和Gapdh基因所获得的Cq值没有差异。此外,酶活检测也发现蛋白质未受RNA纯化的影响。

编辑认为,这种方法能从含有少量细胞的样本中同时纯化mRNA和天然蛋白。当起始材料很少,或需要研究mRNA与蛋白活性的关联时,这特别有用。

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