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抗体制备法的利与弊

日期:2014-05-21 00:00:00

单克隆抗体一直是基础研究、医学诊断和疾病治疗中的重要工具。制备单克隆抗体的传统方法,是诺贝尔奖获得者Georges Köhler和César Milstein在上世纪七十年代开发出来的。这一方法包括:让小鼠接触特定抗原,收集它体内的抗体生产细胞,然后将这些细胞与骨髓瘤细胞融合,形成能够长时间体外培养的杂交瘤。这种技术可以帮助人们生产大量高度特异性的抗体。

然而,动物源的抗体不能用于人体治疗,因为它们会触发人体的免疫反应。为了在人体免疫细胞应答特定病原体时,获取细胞产生的抗体,科学家们又开发了一些新的方法。例如,从血样中分离记忆性B细胞,然后利用Epstein-Barr感染使这些细胞具有永生能力,再在其中筛选能够生成特异性抗体的细胞。“这个方法非常费劲,因为你要制备这些细胞系,对大量的细胞进行筛选,”芝加哥大学的免疫学副教授Patrick Wilson说。另外,不是所有的细胞都能在永生化过程中存活下来,这无疑限制了天然抗体的产量。

最近Wilson等人找到了一个新办法,他们从活跃应答病原体或疫苗的人类血液中,分离具有抗原特异性的单个B细胞,然后对细胞中编码抗体重链和轻链的两个基因进行克隆。这些基因的序列在不同细胞中是有差异的,“不能把细胞混在一起,因为那样你可能得到一个细胞的重链和另一个细胞的轻链”,这样就不能获得天然的重轻链组合。克隆了两个基因之后,就可以在此基础上生产重组抗体,这一技术也被称为表达克隆(expression cloning)。“这个技术没什么限制,只要分离到B细胞就可以制造相应的抗体,”Wilson说。“问题在于实验的步骤比较繁琐。”

表达克隆法最适合“在获得了大量抗原特异性细胞时使用,而这些细胞只有在疫苗接种或感染之后才会出现,”Wilson说。如果没有产生活跃的免疫应答,这个技术鉴定抗体就会非常吃力。因为血液中存在着数百万记忆性B细胞,它们都针对着不同的抗原。

上述技术都是鉴定新抗体和研究人类免疫应答的宝贵工具,不过这些技术都很耗时也比较复杂。为了加快抗体研发的速度,The Scientist杂志联系了相关领域的一些专家,请他们分享了自己使用新兴技术进行抗体鉴定和分离的经验。

基于细胞培养的方法

使用者:NIH国家过敏与传染病研究所的Mark Connors

项目:分离广谱而且强效的新HIV中和抗体

遇到的问题:HIV患者的抗体生产细胞永生化效率较低,就算成功永生化,一些克隆也并不稳定。此前有研究者通过荧光探针从血样中提取抗原特异性的记忆性B细胞,并由此获得HIV中和抗体。Connors及其团队希翼在不依赖已知抗原的条件下,寻找新的HIV中和抗体。(延伸阅读:PNAS:常用HIV药物难以深入淋巴组织)

解决办法:Connors及其团队首先使用流式细胞仪从HIV感染者的血液中分离B细胞。他们并没有采用常规的表达克隆(克隆各个细胞的重链和轻链基因),而是将分离到的细胞分装在384孔板中。他们用滋养层细胞和信号分子保持B细胞的活性,同时刺激它们分泌抗体。在大约两周后,研究人员检验了每个孔上清液在体外中和HIV的能力。随后,他们选取了有中和能力的细胞,并对其中的抗体基因进行克隆,最后制成重组抗体。Connors和他的团队用这一方法,分离了两个能够强力中和多种HIV病毒株的新抗体。

优点:

•使用者不需要事先知道抗体的结合特异性

•可以用于多种疾病。“只要你有能够进行筛选的目标功能,就可以提取抗体,” Connors说。

•完成整个过程只需要三周,Connors说。

•滋养层细胞可以通过AIDS reagent program免费得到

缺点:

•中和分析所需的试剂比较贵

•理论上这一方案可以手动完成,但需要筛选的孔很多(Connors筛选了60,000–140,000个孔),因此这一技术更适合拥有自动化液体处理设备的实验室。

•一些抗体生产细胞可能在培养过程中无法存活。

成本:据Connors估计,每个384孔板大约需要$400–$500。手动操作一般需要约20块板,自动化实验操作一般需要60–80块板,具体还是要看血样中有多少B细胞。

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