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加速干细胞疗法的基因表达分析技术

日期:2014-07-18 00:00:00

最近,美国国立卫生研究院(NIH)的研究人员开发出一种技术,将加快干细胞衍生组织的生产。

这种方法可同时测量多个基因的表达,使科学家们能够根据细胞的功能和发育阶段,快速地描述细胞。该技术将帮助研究人员使用患者的皮肤,再生视网膜色素上皮细胞(RPE,眼睛后面的一种组织,在几种致盲眼疾中受影响)。这种技术还将帮助科学家为个性化治疗找到药物。

NIH国家眼科研究所(NEI)眼睛和干细胞转化研究部门的Kapil Bharti博士指出:“大家对细胞和组织的鉴定能力,已经限制了干细胞疗法的发展进步。这种检测方法扩展了这种能力,并简化了这个过程。”相关研究结果发表在最近一期的美国科学杂志《Stem Cells Translational Medicine》。

RPE是一层与视网膜相邻的细胞,通常被称为视杆细胞和视锥细胞的光感受器位于那里。RPE支撑光感受器的功能。几种疾病可引起RPE破裂,进而导致感光细胞和视力的丧失。

Bharti博士用以制造RPE的干细胞是诱导多能(iPS)干细胞,是通过将成熟细胞恢复到未成熟状态(类似于胚胎干细胞)而产生的。iPS细胞可以来自于患者的皮肤或血液细胞,被诱导为其他细胞类型(例如神经元或肌肉),从理论上说,这些细胞重新植入后不会引起免疫排斥反应。

为了验明由iPS细胞制成的RPE的“正身”,科学家们用显微镜来确保组织看起来像RPE,用生理学试验来确保组织的行为像RPE。他们还利用一种称为定量RT-PCR的技术来测量某些基因的表达,这些基因指示正在进行中的细胞发育和功能。例如,iPS细胞中SOX2基因的表达高于成熟RPE。

但是,定量RT-PCR只允许同时测量每个样本中的几个基因。Bharti博士与NIH国家推进转化科学中心(NCATS)的Marc Ferrer博士联手,开发出一种多重检测方法,这种方法可以一种高度自动化的方式,同时检测每个RPE样本中的多个基因。该方法基于Affymetrix生物科技企业的市售平台。在试验中,研究人员将微小的DNA片段拴到微珠上,用来捕获当RPE样品中细胞表达基因时所产生的RNA分子。一旦被捕获,来自不同基因的RNA就被贴以荧光标记。

研究人员首先利用来自皮肤活检的细胞,产生了iPS衍生的RPE,然后检测了8个基因的表达,这些基因是发育、功能和疾病的标记。他们利用定量RT-PCR一次一个地检测了每个基因的RNA水平,然后利用多重检测同时测量了多个基因。当进行对比时,这两种检测的结果具有相关性。

然后,研究人员利用多重检测,对iPS衍生RPE 、iPS细胞和从眼睛培养的RPE细胞的基因表达,进行了比较。与iPS细胞相比,iPS衍生RPE表达较低水平的SOX2和较高水平的RPE特异性基因PAX6、RPE65、RDH5、TRPM1和BEST1。与培养的RPE相比,iPS衍生RPE表达较高水平的SOX2和PAX6——两种发育标记,但是表达较低水平的RPE特异性基因,表明一种相对不成熟的状态。

Bharti博士指出:“这份报告演示的原理证明表明,可以利用一种完全自动的高通量检测方法,测量iPS衍生RPE中的相关基因表达变化。一旦有了这种检测方法,研究人员的成本可以减半,可用较少的细胞和较小的溶液体积,增加产出。”

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Bharti博士及其NEI的同事,正在与纽约干细胞基金会合作,从老年性黄斑变性(AMD,老年人视力丧失的最常见原因)患者和其他罕见遗传性眼疾患者中产生iPS细胞系。通过一个中央存储库,这些iPS细胞系可被用于整个科学界。Bharti博士将从这些细胞系中产生RPE来研究AMD。

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